青少年特發性脊柱側凸(AIS)是一種以脊柱三維畸形為主要特征的骨科疾病，多發生於10～18歲青少年，其約占所有脊柱側凸的90%，影響1%～3%青少年的身心健康[1-2]。該病具有一定的遺傳傾向性，但具體病因未明，且存在明顯的Carter效應，女性發生率約為男性的2～10倍，可能與多基因遺傳模式相關，男性需更大的遺傳負荷才會發病[3]。

        SPRY4基因屬於可編碼富含半胱氨酸和脯氨酸蛋白質家族的成員之一，具有調控生長發育的作用。本團隊前期研究發現，AIS患者骨髓間充質幹細胞(MSCs)中SPRY4水平顯著下調，敲低SPRY4或SPRY4表達缺失可損害MSCs向成骨細胞分化，導致骨骼發育異常，可能為AIS的誘發因素[4]。

        此外，本研究團隊在AIS患者MSCs中發現54個既往未被識別的差異性表達的微RNA(miRNA)，其可通過多種信號通路調控MSCs分化[5]。由於SPRY4基因單核苷酸多態性(SNP)亦可影響MSCs分化，推測其可能通過與miRNA相結合，進而發揮影響MSCs分化、促進AIS發病的效應。

        miRNA主要與3′非編碼區(3′UTR)結合[6]，此區域不僅可在調節 mRNA 定位方麵發揮重要作用[7]，同時是調控 mRNA 穩定性、正確時空翻譯的重要結構[8]，有助於揭示人類疾病和進化的因果關係[9]。本研究針對3′UTR區域位點，首次探究了中國漢族人群SPRY4基因多態性與AIS的相關性，以期為AIS病因學研究提供新的證據。

        1 材料與方法

        1.1研究對象

        本研究為回顧性分析，研究對象為2017年12月—2021年12月北京協和醫院AIS患者及健康受試者。

        AIS患者納入標準：(1)依據臨床表現及正側位X線片確診為AIS且Cobb角>20°;(2)發病年齡為10～18歲;(3)中國北方地區(黃河以北的區域，如河北省、山東省、山西省、北京市和天津市等)漢族人群。

        排除標準：(1)合並其他原因導致的脊柱畸形;(2)影像學資料不完整;(3)合並影響骨骼發育的慢性疾病。

        健康受試者納入標準：(1)體檢健康，無研究相關疾病;(2)中國北方地區漢族人群;(3)按照年齡、性別與AIS患者進行1:1匹配。排除標準：(1)全脊柱X線片、MRI等影像學資料不完整者;(2)合並影響骨骼發育的慢性疾病。

        本研究已通過北京協和醫院倫理審查委員會審批(審批號：JS-3403)，並豁免患者知情同意。

        1.2 研究方法

        收集AIS患者的AIS分型及AIS患者與健康受試者年齡/性別信息、SPRY4基因測序結果。AIS主流的手術分型包括King分型、Lenke分型及PUMC分型，其中以PUMC分型的可信度和可重複性最佳，且適合脊柱三維矯形，其將AIS分為Ⅰ型(單彎)、Ⅱ型(雙彎)和Ⅲ型(三彎)[10]。本研究根據全脊柱X線片，記錄AIS患者的PUMC分型。

        SPRY4基因檢測方法：(1)樣本收集：采集空腹外周靜脈血2 mL置於EDTA抗凝管中，-80 ℃保存備用。(2)基因組提取及測序：采用酚-氯仿抽提法提取全基因組DNA，並溶於TE緩衝液。基因組DNA經Nano Drop分光光度計測定純度和濃度後，采用全基因組測序方法對SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點SNP進行分型檢測，記錄各位點等位基因頻率、基因型、遺傳模式等，所有測序工作均由深圳華大基因科技有限公司完成。

        1.3 樣本量估算

        本研究為病例對照研究，以C等位基因頻率作為主要觀測指標進行樣本量估算。檢索國家生物技術信息中心數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=)後發現，AIS患者rs10040443位點等位基因C的頻率為8.4%，而健康人群僅為5%，在檢驗水準a=0.05，把握度為90%，樣本比例為1:1的情況下，經計算兩組所需最低樣本均為97例。

        1.4 統計學處理

        采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。等位基因頻率、基因型、PUMC分型等計數資料以頻數(百分數)表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法。采用卡方檢驗進行Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗。采用多因素Logistic回歸法分析SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點SNP與AIS的關聯性。以P<0.05為差異具有統計學意義。

        2 結果

        2.1 一般臨床資料

        共入選符合納入與排除標準的AIS 患者97例，健康受試者100名。健康受試者中，男性15例，女性85例;平均年齡(14.48±1.13)歲;SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點均符合Hardy Weinberg遺傳平衡定律(P均>0.05)，提示各位點基因分布處於平衡狀態，樣本具有代表性。AIS 患者中，男性13例，女性84例;平均年齡(14.45±1.11)歲;rs10040443基因型頻率分布偏離Hardy Weinberg遺傳平衡定律，提示與疾病易感性存在關聯。

        2.2 SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點基因型及等位基因分布與AIS的關聯性

        AIS患者rs10040443位點等位基因C及CC基因型頻率均高於健康受試者(P均<0.05)，rs3797053位點等位基因頻率及基因型分布與健康受試者均無顯著差異(P均>0.05)，見表1。

        表1AIS患者與健康受試者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點基因型及等位基因分布比較[n(%)]

        進一步采用多因素Logistic回歸分析校正性別因素後發現，在各種遺傳模式下，rs3797053位點多態性與AIS均無明顯關聯性(表2);

        表2校正性別因素後，SPRY4基因rs3797053位點與AIS的關聯性分析[n(%)]

        在共顯性、隱性及加性遺傳模式下，rs10040443位點多態性與AIS存在關聯性，其CC基因型可增加AIS發生風險(表3)。

        表3校正性別因素後，SPRY4基因rs10040443位點與AIS的關聯性分析[n(%)]

        2.3 AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點基因型與性別及PUMC分型的關聯性

        AIS患者中，SPRY4基因rs3797053位點基因型分布與性別、PUMC分型均無明顯關聯性(P均>0.05);rs10040443位點基因型分布與性別亦無明顯相關(P>0.999)，但與PUMC分型具有一定關聯性(P<0.001)，CT+TT基因型患者中PUMC Ⅱ型的比例顯著高於CC基因型患者(66.67% 比0，P<0.001)，見表4。

        表4不同性別、PUMC分型AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位點基因型分布比較[n(%)]

        3 討論

        本研究基於病例對照設計，首次探究了中國北方漢族人群SPRY4基因多態性與AIS的相關性，結果發現AIS患者SPRY4基因rs10040443位點等位基因C及CC基因型頻率均較健康受試者升高;校正性別因素後，rs10040443位點在共顯性、隱性及加性遺傳模式下均與AIS具有關聯性，該位點CC基因型與AIS發生風險增加有關。

        在SPRY4基因多態性與性別、AIS臨床表型相關性的分析中發現，rs10040443位點基因型與PUMC分型亦存在一定關聯性，提示SPRY4基因rs10040443位點可能參與了AIS發病，為該病的病因學研究提供了新思路。

        SPRY可通過特異性抑製成纖維細胞生長因子(FGF)受體、表皮生長因子(EGF)受體和血管內皮生長因子(VEGF)受體活性，在人類胚胎幹細胞增殖與存活的調控中發揮重要作用。

        目前已知的SPRY家族由SPRY1、SPRY2、SPRY3及SPRY4組成[11-13]，其中SPRY1 和 SPRY2 編碼蛋白是晶狀體囊泡分離和角膜分化的必需物質，SPRY3參與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的負性調控[14]。

        SPRY4基因位於5q31.3，由5個外顯子組成，其編碼蛋白為受體轉導的MAPK信號通路抑製劑，並可破壞活性單體GTP結合蛋白(GTP-RAS)的形成。

        研究顯示，SPRY4 是人類胚胎幹細胞中表達最高的兩個Sprouty 家族成員之一[15-18]。在不同類型細胞中，SPRY4調控生長因子信號的應答效應存在差異[19]。

        Li等[20]研究發現，SPRY4在體內與體外對人脂肪源性間充質幹細胞(hAMSCs)的脂肪形成均有促進作用。與之不同，沉默C57BL/6小鼠骨髓中SPRY4表達可阻斷脂肪堆積，該現象或可解釋AIS患者體脂率普遍較低的原因[21]。由於肌肉和脂肪含量增加分別可將脊柱側凸發生風險降低20%和13%[22]，而SPRY4蛋白可調控脂肪形成，故推測其與AIS具有一定相關性。

        此外，成骨細胞和軟骨細胞分化功能障礙可能是AIS的促進因素，敲低健康人群軟骨細胞中SPRY4基因可引起軟骨細胞肥大、衰老、活性降低，並促進活性氧和細胞外基質表達，進而導致脊柱兩側軟骨生長板生長速度不一致，誘發AIS[23]。

        既往文獻已證實，3′UTR區域可與miRNA相結合發揮骨骼生長發育調控作用。如Song等[24]研究發現，rs4148941位點(A等位基因)轉錄物與miR-513a-5p的相互作用可能與腰椎間盤退變具有一定關聯性。FGF2的3′UTR區域中存在與中國人群骨礦物質密度相關的位點，且其功能受miR-196a-3p的調節[25]。檢索文獻未發現SPRY4基因多態性與AIS關聯性的相關研究。

        本研究以rs3797053與rs10040443位點為切入點，首次在中國漢族人群中探究了SPRY4 基因多態性與AIS的關聯性。此兩個位點均位於3′UTR區域，且次要等位基因頻率均大於5%。單因素分析顯示，rs3797053位點等位基因頻率及基因型分布在AIS患者與健康受試者之間無顯著差異，AIS患者rs10040443位點等位基因C及CC基因型頻率高於健康受試者，提示rs10040443位點可能與AIS發病具有相關性;校正混雜因素後此種相關性仍存在，認為rs10040443位點CC基因型可能增加AIS發生風險。

        準確的AIS分型是製訂臨床治療決策的前提和基礎。AIS 主要包括三大分型係統，即King 分型、Lenke分型及PUMC分型，其中PUMC分型更適合指導AIS患者進行三維矯形[26]。本研究發現AIS患者SPRY4基因rs10040443位點CC+TT基因型與PUMC Ⅱ型具有一定關聯性，CC+TT基因型的AIS患者更可能表現為PUMC Ⅱ型。由於AIS由多個基因調控且受多個環節、多種因素的影響，這可能從理論層麵解釋了AIS患者存在不同程度畸形的原因。

        本研究局限性：(1)雖然初步認為SPRY4基因rs10040443位點多態性與AIS具有相關性，但目前尚缺乏足夠的分子機製研究證據，二者是否具有因果關係尚需進一步驗證。(2)AIS患兒在10～18歲期間，其脊柱畸形分型呈現為動態演變的狀態，本研究PUMC分型僅為其中一個時間點的靜態影像結果，以致研究結果可能存在偏倚。(3)本文研究對象均為中國北方漢族人群，結果外推需謹慎。

        綜上所述，SPRY4基因rs10040443位點多態性可能與中國北方地區漢族人群AIS具有相關性，該位點CC基因型可能為AIS的危險因素。此外，CT+TT基因型與PUMC Ⅱ型亦具有一定相關性，若AIS患者基因檢測結果為CT+TT基因型，則其後期進展為PUMC Ⅱ型的風險增加，該基因位點有望成為預測AIS進展情況的參考指標，並輔助臨床進行早期幹預。本研究結果有助於明確SPRY4基因多態性與中國漢族人群 AIS 易感性的關係，為該病的病因學研究提供了新思路，並為臨床幹預提供了依據。

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