基因編輯新方法的發展使人類基因治療(HGT)應用得以擴大發展。許多HGT策略都是通過添加DNA有效載體將治療基因傳送到受體中，以彌補遺傳缺陷或為受體細胞提供合成功能。傳統上，治療性基因的傳遞是基於病毒和非病毒載體的，但其在基因組的整合位點不受控製，可能會給受體帶來負麵影響。

        近年來，基於ZFN、TALENs和CRISPR-Cas9等工具的精準遞送策略已實現快速發展，相對於傳統的基於慢病毒(LV)載體、 rAAV載體和PiggyBac轉座酶等技術而言，其可以在一定程度上避免意外的基因破壞或激活。在不受控製且精確的基因遞送策略中，了解整合事件的綜合特征對於評估安全性和精確性至關重要。因此，進入基因治療時代，人們必須全麵、綜合地了解和評估這些治療“載體”的精準性及其能否整合在基因組上的插入位點。

        近日，西班牙巴塞羅那龐培法布拉大學的科研人員在Genome Biology上發表了題為“INSERT-seq enables high-resolution mapping of genomically integrated DNA using Nanopore sequencing”的文章。研究團隊開發了一種名為“INSERT-seq”的測序方法，其主要工作流程包括single-tail adapter/tag(STAT-PCR)文庫製備和牛津納米孔(Oxford Nanopore)長讀長測序。INSERT-seq方法將整合DNA的靶向擴增、基於唯一分子標記(UMI)的PCR偏差校正以及Oxford Nanopore長讀長測序相結合，可以穩健、快速和低成本的方式解析已編輯的基因組中未知的有效載體整合位點，定量分析不同體外、體內樣本的DNA整合特征，檢測極限為1%。

        主要研究內容

        增加reads長度提高對基因組插入事件的分辨率

        為確定增加reads長度可以提供的分辨率增益，研究團隊生成了一個模擬數據集，增加了插入-基因組結合位點的reads長度。當reads大小從250bp增加到1000bp時，檢測到的整體插入位點增加了3.9%(圖1a)。研究團隊觀察到，被短讀長測序跳過的重複區域的結合位點是基因組中最長的可移動基因元件(MGE);插入位點對reads長度具有明顯的依賴性，當reads長度增加時，該方法的敏感性也會增加。此外，在反轉錄轉座子LTR、LINE和SINE中，研究團隊使用長讀長測序分別檢測到4、3和2個新的插入位點(圖1b)。

        圖1. read長度對解決插入部位的影響。來源：Genome Biology

        接下來，研究團隊在模型預測的最佳範圍內使用嵌套的single-tail adapter/tag(STAT-PCR)與納米孔測序耦合以獲得長讀長插入連接捕獲(圖2a)，並在含有多個慢病毒插入的克隆擴增等基因細胞係(MOPO樣本)上，將基於納米孔的INSERT-seq與基於短讀長測序的平台進行比較。結果顯示，INSERT-seq檢測到3個新插入(7.3%)，其分別位於chr1、chr4、chr7處。

        上述分析的MOPO樣品中，在重複區域中發現的插入包括LINE、SINE、LTR等反轉錄轉座子和DNA轉座子(圖1d)，並且插入優先發生在內含子區域，其百分比高於隨機分布的模型樣本(圖1e)。載體首選區域中重複元件豐度的變化可能會導致插入位點的整體檢測結果不同，使得每個載體在解析位點選擇方麵的reads長度影響是可變的(圖1d)。

        圖2. 優化的INSERTseq協議的實施。來源：Genome Biology

        為確定INSERT-seq檢測限(LOD)，研究團隊將一個在chr12位點有靶向插入的單克隆細胞係(MN2)和一個在chr6位點有插入的不同單克隆細胞係(MN7)進行恒定量的稀釋，稀釋倍數分別為1:1、1:10、1:100、1:1000和1:10000。在稀釋度為1:100時檢測到目標整合位點，從而確定INSERT-seq檢測限為1%。

        探究rAAV-8在小鼠肝髒中的全基因組整合和Cas9-PiggyBac嵌合轉座酶的整合效果

        為評估體內模型中INSERT-seq的性能，研究團隊分析了重組腺相關病毒(rAAV)血清型8的小鼠的肝組織，以確定rAAV的全基因組整合圖譜(圖3a)。結果共檢測到55次插入，其中有37次在兩次重複之間是相同的(圖3b);rAAV在內含子區域的優先插入(圖3c)，且插入位點與開放染色質區域相關(與ATAC-seq和DNAseI數據集相比)(圖3d)。

        圖3. INSERT-seq揭示了rAAV-8和PB基因組編輯框架中的整合模式。來源：Genome Biology

        為評估INSERT-seq在分析新興精確基因遞送載體方麵的潛力，研究團隊確定了先前報道的Cas9-PiggyBac嵌合融合體的整合位點。通過INSERT-seq分析，研究團隊在Cas9誘導的TRAC位點雙鏈斷裂處檢測到了插入，與總整合量相比，其插入量很低，脫靶率為98%(圖3e, f)。這可能是由於轉座子轉染的時間過長(約3周)，特定位點對攜帶插入的克隆進行了正向選擇。因此，在質粒側翼區域添加PCR阻斷寡聚物可能是提高新轉染細胞插入位點覆蓋率的一個解決方案。

        總 結

        綜上所述，INSERT-seq將基於擴增的富集、UMI擴增校正以及處理整合位點的計算框架相結合。與傳統的短讀長測序方法相比，INSERT-seq能以更高的分辨率解析DNA整合位點，為確定重複區域的整合提供更高的準確性。研究團隊已成功通過INSERT-seq方法分析了體外和體內樣本基因組中的LV、轉座子和rAAV DNA有效載體。此外，INSERT-seq還可用於捕獲基因組中任何DNA有效載體的規範整合，將其與引物拚接結合，較高的檢測靈敏度可以提高對基因組破壞事件和非規範整合結果的檢測。

        參考文獻：

        Ivančić, D., Mir-Pedrol, J., Jaraba-Wallace, J. et al. INSERT-seq enables high-resolution mapping of genomically integrated DNA using Nanopore sequencing. Genome Biol 23, 227 (2022). https://doi.org/10.1186/s13059-022-02778-9