新型肺炎患者急需有效的治療療法，美國霍普⾦斯醫院病理科醫師、⼄肝病毒研究專家提出他認為最佳的可⾏⽅案。

        Robert L. Kruse醫生是美國霍普⾦斯醫院病理科醫師、⼄肝病毒研究專家，他密切關注著本次新型冠狀病毒疫情。

        他對目前治療策略作出了一篇綜述，並就藥物開發方案提出了他的專業建議。《醫學界》有幸得到他的獨家授權，將其節選刊發如下，以期對本次疫情控製、治療方案擬定及新藥開發有所幫助。

        本⽂將概述可⽤於治療 2019-nCoV 病毒的不同潛在治療⽅案，在對 2019-nCoV 研究有限的情況下，將重點放在可以在患者中快速測試且⼴泛應⽤的藥物研發上。

        簡⽽⾔之，在基礎實驗室中進⾏ 2019-nCoV 研究的時間有限，而已感染的

        患者又急需有效的治療療法。Robert L. Kruse醫生最終提出他認為最佳的可⾏⽅案，以及有關如何製造這種融合蛋⽩⽤以快速應⽤於患者治療。

        抗 2019-nCoV 治療⽅法綜述

        1.研製抗 2019-nCoV 中和抗體

        冠狀病毒進⼊細胞始於 S 蛋⽩與細胞表⾯靶受體的結合，在細胞膜融合後將病毒核⾐殼傳遞到細胞內以進⾏複製。S蛋⽩以引起感染細胞與周圍其他帶有同樣受體的細胞形成合胞體⽽聞名，S蛋⽩在病毒體狀態下不起作⽤。

        以2019-nCoV表⾯的S蛋⽩為⽬標的中和抗體可能是學術和⼯業⽣物醫學研究⼈員預想的第⼀種療法，對疾病產⽣被動免疫。

        最近公布的2019-nCoV基因組序列(GenBank：MN908947.3)使研究⼈員可以在實驗室中進⾏基因合成，並考慮將S蛋⽩表達為免疫原。傳統的篩選⼩⿏或兔中和抗體的⽅法對於此次暴發來說可能太慢，但是更快的⽅法，例如使⽤表達抗體⽚段的噬菌體或酵母表達⽂庫，可以快速⽤於鑒定病毒中和的主要候選物。

        挑戰在於，任何候選抗體都需要在細胞培養和動物模型中進⾏嚴格測試，以確認其能夠中和2019-nCoV並防⽌感染。此外，需要測試在⼈群中傳播的⼏個分離株，以評估中和抗體的覆蓋範圍是否⾜夠⼤。來⾃其他冠狀病毒種類(如SARS)的信息將有助於確定最佳抗原決定簇的位置，以產⽣中和抗體(S蛋⽩中的受體結合域是⼀個關鍵⽬標)，但這也是⼀個緩慢⽽具有挑戰性的過程，⼏個⽉內可能不會產⽣顯著的成效。

        此外，最終可能需要混合抗體來確保對患者的充分保護，這將增加配⽅和製造的複雜性。像以下討論的⼀些治療⽅案⼀樣，在低等⽣物(細菌、酵母、昆⾍細胞)中表達任何主要表達候選物的能⼒將有助於加快產⽣對患者的治療藥物。

        產⽣針對 2019-nCoV S 蛋⽩的中和抗體的另⼀種策略是⽤ 2019-nCoV S 蛋⽩免疫⼤ 型動物(綿⽺、⼭⽺、⽜)，然後從動物中純化多克隆抗體。 這⼀策略可以在爆發的情況下提供快速服務，並且具有許多優點，例如簡化⽣產和製造，但是不能保證每隻動物產⽣中和抗⾎清或每隻動物的抗體滴度。 此外，⼈類對其他物種的外來免疫球蛋⽩也有免疫反應，這可能使各種治療⽅案複雜化。 在真正的絕境下，這種策略在短期內可能是可⾏的，但在 2019-nCoV 疫情中不容易擴⼤規模，因為該疫情已經迅速蔓延。

        2.使⽤針對 2019-nCoV RNA 基因組的寡核苷酸

        除了靶向2019-nCoV的表⾯蛋⽩，還可以靶向RNA基因組本⾝使其降解。最近發布了2019-nCoV的RNA基因組序列(GenBank：MN908947.3)，當時可以考慮的⼀個策略是使⽤⼩⼲擾RNA(siRNA)或反義寡核苷酸(ASO)通過靶向其RNA基因組來對抗病毒。

        這⼀策略⾯臨多重挑戰。

        ⾸先，CoV2019的保守RNA序列域未知。鑒定保守序列對於優化siRNA靶向和避免寡核苷酸策略的病毒逃逸⾄關重要。可以通過觀察2019-nCoV與SARS病毒的基因組同源性來⽐較保守序列，但這仍然是猜測。

        第⼆個挑戰是如何輸送寡核苷酸到肺部。遞送載體如脂質納⽶粒已經取得進展，其可以介導遞送⾄肺部。然⽽，尚不清楚是否有⾜夠的siRNA或ASO被有效遞送⾄肺部，從⽽阻⽌感染或改變其臨床進程。例如，如果肺中25%的肺泡上⽪細胞含有siRNA或ASO，這種效率對於傳統的基因治療可能是⼀個巨⼤的成功，但是對於病毒感染⼏乎沒有任何影響。盡管臨床前動物模型取得了顯著成功，但這種解釋也很可能是抗埃博拉的siRNA候選藥物在試驗中失敗的原因。

        最後，即使假設siRNA在臨床上有效，將siRNA藥物的⽣產擴⼤到⼤量受感染⼈群的能⼒也有限。

        ⽬前的siRNA和ASO療法是為罕見疾病製造的，且沒有可⽤的資源來快速製造這些藥物。

        3.重新利⽤⽬前可⽤的抗病毒藥物

        對抗2019-nCoV的理想藥物是獲批的⼩分⼦藥物，它們可以抑製病毒⽣命周期的不同階段，最終抑製其複製。兩類潛在⽬標是病毒聚合酶和蛋⽩酶抑製劑，它們都是⼈類免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)抗病毒⽅案的組成部分。

        絕望的臨床醫⽣已經⽤各種重新利⽤的抗病毒藥物進⾏了試驗性臨床研究。除了病例報告之外，以前的每⼀次病毒爆發都是如此，但收效甚微。事實上，在埃博拉爆發期間，沒有⼀種重新利⽤的⼩分⼦藥物被明確證明能改善所有患者的臨床病程。

        2019-nCoV可能有所不同，有初步的陽性報告表明，作為 HIV 蛋⽩酶抑製劑的洛⽪納韋和利托納韋對 2019-nCoV 具有⼀定的臨床療效，類似於之前⽤於抗SARS的研究。應繼續開展研究，在2019-nCoV細胞培養模型中篩選其他臨床可⽤的抗病毒藥物，希望出現⼀種對該病毒有⽤的候選藥物，並能在臨床上迅速應⽤。

        ⼀個有希望的例⼦是remdesivir，它能⼲擾病毒聚合酶，並在⼩⿏模型中顯⽰出對MERS 的療效。 如需更多信息，請查閱以往針對冠狀病毒的藥物再利⽤⼯作。 盡管這些重新利⽤的藥物可能有希望，但仍然有理由尋求新的2019-nCoV特異性療法來補充潛在的重新利⽤的候選藥物。

        4.從恢複期患者⾎清中提取抗體進⾏被動免疫

        ⼀個簡單但可能⾮常有效的可⽤於傳染性疫情的⼯具，是使⽤從病毒感染中恢複的患者⾎清來治療之後感染病毒的患者。病毒感染得到解決的患者將對2019年的不同病毒抗原產⽣多克隆抗體免疫應答。從病毒感染中恢複的患者將對2019-nCoV的不同病毒抗原產⽣多克隆抗體免疫應答。這些多克隆抗體中的⼀些可能會中和病毒並防⽌新⼀輪感染，已從病毒感染中恢複的患者應產⽣⾼滴度的2019-nCoV抗體。

        2019-nCoV 已恢複的患者隻需捐獻⾎漿，然後將⾎漿輸⼊感染患者體內。鑒於⾎漿捐獻是成熟的⽅法，並且⾎漿輸注也是常規醫療護理，該建議不需要任何新的科學或醫學批準即可實施。事實上，在2014-2015年埃博拉爆發期間，⽤相同的原理，即使⽤恢複期⾎清治療了⼏名埃博拉患者，其中包括兩名感染的美國醫護⼈員。

        隨著疫情的繼續，將有更多幸存的患者成為2019-nCoV抗⾎清的捐獻者，並且可以開發出⼤量抗⾎清⽤於治療病情最嚴重的患者。不幸的是，疫情的指數級增長將與這⼀策略背道⽽馳，因為病例數量的增長可能超過先前患者提供供體⾎漿作為治療的能⼒。此外，康複患者⾎清在抗病毒作⽤的效⼒上會有顯著的變異性，使其不太理想。雖然輸⾎醫療服務現在當然應該將康複期患者⾎清作為患者治療的⼀種選擇，但最終在控製疫情的有效範圍上受到限製。

        關於新 2019-nCoV 治療⽅法的建議

        最近的研究發現，2019-nCoV 使⽤⾎管緊張素轉化酶2(ACE2)作為細胞進⼊的受體 ，這與 SARS 冠狀病毒⽤於進⼊的受體相同。這兩種冠狀病毒都通過病毒體上的S蛋⽩與 ACE2 結合，病毒膜和細胞膜融合，隨後 RNA 病毒將在細胞內複製其基因組並最終產⽣新的病毒顆粒，這些病毒顆粒將被分泌以感染其他細胞。SARS 和 2019-nCoV 都使⽤ ACE2 受體這⼀巧合使將 SARS 進⼊細胞機製相關研究成果應⽤於 2019-nCoV 成為可能。根據 SARS 相關⽂獻，有以下⼏種策略在防⽌ SARS 模型中能夠有效預防感染。

        1.結合 ACE2 受體的阻斷劑

        第⼀種策略是給患者服⽤⼀種能與 ACE2 結合的藥物。這⾥的關鍵優勢是宿主 ACE2 蛋⽩不會改變，因此不需要擔⼼與藥物的結合會脫靶。此外，在此次疫情爆發的時間範圍內，病毒將⽆法突變和結合全新的宿主受體;這種功能關係是通過長期進化建⽴的。類似地，流感病毒每年都會改變其表⾯的突變以逃避抗體中和，但它總是使⽤細胞表⾯的唾液酸作為受體進⼊細胞。

        阻斷劑結合到 ACE2 有兩個已知選項。

        第⼀種⽅法是使⽤ SARS 病毒 S 蛋⽩的⼩受體結合域(RBD)。

        該結合域已被證明是進⼊細胞過程中結合 ACE2 受體的關鍵域。使⽤該結合域(⼤⼩為 193 個氨基酸)已被證明能有效阻⽌ SARS 進⼊細胞培養。傳染性 SARS RBD 可以給病⼈服⽤，從⽽使他們的 ACE2 蛋⽩與靶細胞結合，防⽌感染，這是完全合理的。

        第二種，也有可能⽣產出 2019-nCoV 的等效RBD，並⽤作治療⼿段。該策略假設 SARS 和 2019-nCoV 在 ACE2 上具有相同的結合位點，鑒於 SARS 和 NL63 冠狀病毒具有相似的 ACE2 結合位點，這種可能性很⼤。這種分⼦很⼩(類似於駝類抗體的納⽶體的⼤⼩)將增強⽣物向組織的灌注，以更有效地結合病毒使⽤的受體。就正在發⽣的疫情⽽⾔，這種⼩蛋⽩質可在細菌蛋⽩表達係統中快速產⽣，這將有助於提⾼產量。此外，中國已經有很多藥⼚擁有細菌蛋⽩表達係統，將允許 RBD 蛋⽩快速投⼊⽣產。

        或者也可以將 RBD 蛋⽩連接到⼀個 Fc ⽚段上，⽤於延長半衰期，在 MERS 相關研究中曾合成這個 212個氨基酸的結構域。MERS RBD-Fc 融合體證明了阻斷病毒對細胞受體感染的能⼒，以及刺激⼩⿏對該特定病毒域的免疫反應的能⼒。值得注意的是，由於 RBD-Fc融合體將與正常細胞結合，⼈們希望通過突變來消除 Fc 受體結合造成的細胞毒性 Fc 結構域功能。

        第⼆個類似的策略是使⽤⼀種能結合 ACE2 蛋⽩的抗體，從⽽防⽌ 2019-nCoV 感染

        實驗表明，該策略能有效阻⽌SARS的進⼊和複製。雖然⽂獻索引中沒有公布 ACE2 抗體序列，但單克隆抗體確實存在，相關雜交瘤序列可以在⼏天內克隆。使⽤這種策略不需要擔⼼ACE2結合抗體的任何病毒逃逸，這是相⽐於針對S蛋⽩的中和⽅法的優勢。

        在考慮如何使⽤ ACE2 抗體策略時應注意以下問題。應該去除Fc結構域的功能，這樣就不會在表達 ACE2 的正常組織中引起炎症。這將保持 Fc 結構域賦予的長半衰期⽽沒有任何副作⽤。包含Fc結構域的缺點是需要使⽤更昂貴的哺乳動物細胞⽣產係統來保持適當的糖基化，這在疫情爆發情況下會延長將藥物供給患者的⽣產時間。或者可以隻使⽤⼀個結合 ACE2 的單鏈可變⽚段(scFv)。駝類抗體的納⽶體或 VHH 域也是另⼀種選擇。其結構很⼩可以在細菌中⽣產，可以快速滲透到不同的組織，缺點是沒有Fc結構域的這些分⼦半衰期較短。

        這兩個選項的應⽤有⼏個限製。

        關於 SARS RBD 策略，⼈體最終可能會對 SARS 蛋⽩產⽣免疫反應，盡管抗擊 2019-nCoV 的關鍵感染⼲預期可能等不及這些免疫反應的發⽣，但在這⼀時間窗之後將對兩種冠狀病毒都產⽣免疫反應。或者，如果使⽤ 2019-nCoV 的同源 RBD 本⾝，這種免疫反應可能是⾮常有利的，因為它可以同時產⽣阻斷效應和疫苗接種效應。

        對於這兩種策略，阻斷體內不同器官的ACE2受體所需的劑量是未知的，為了減緩感染需要飽和的 ACE2 受體的百分⽐也是未知的。體內ACE2受體的數量最終可能會阻礙這⼀策略。此外，細胞表⾯ ACE2 受體的代謝更新也將影響治療蛋⽩需要給藥的頻率。為了解決這個問題，可以通過霧化對肺部進⾏局部給藥，在肺部感染的關鍵部位增加抗ACE2治療的濃度。最終，患者的臨床試驗需要明確這些潛在的問題。

        2.免疫粘附蛋⽩ ACE2-Fc 策略

        該策略旨在合成⼀種與冠狀病毒本⾝結合的抗體樣分⼦，⽽不是保護細胞不被感染。對於此策略，建議使⽤可溶形式的ACE2受體，該受體可與2019-nCoV的S蛋⽩結合，從⽽中和病毒(圖1)。

        同樣，對 SARS 病毒的研究表明，這種策略具有潛在的前景。可溶性 ACE2 受體被證明可以阻⽌ SARS 病毒感染體外培養的細胞。可溶性 ACE2 與 SARS S蛋⽩的親和⼒為 1.70 nM，與單克隆抗體的親和⼒相當。2019-nCoV 對 ACE2 的親和⼒可能相似。

        為了將 ACE2 ⽤作治療患者的治療⽅法，建議將可溶性 ACE2 轉化為與免疫球蛋⽩ Fc 結構域融合的免疫粘附蛋⽩ 形式，從⽽延長循環分⼦的壽命，同時還招募免疫係統攻擊病毒。盡管未在動物模型中進⾏測試，但前期研究表明與⼈IgG1 域融合的 ACE2 細胞外域(ACE2-NN-Ig)在體外有效中和 SARS 冠狀病毒，抑製濃度為 2 nM54，抑製率為50%。這項研究也提供了證據證明 ACE2-Fc 可以在體外實驗中抑製 2019-nCoV，並有望在患者中同樣有效。

        具體地說，ACE2 蛋⽩的細胞外結構域將合成到⼈免疫球蛋⽩G的Fc結構域上(圖 2A)。研究表明，ACE2 氨基酸 19 – 615 ⾜以與 SARS S 蛋⽩結合55，盡管使⽤更⼩的細胞外結構域也有可能已經⾜夠了。這將⼩於以前開發的免疫粘附蛋⽩54。進⼀步的研究可以關注使⽤更⼩的ACE2 結構域就⾜以結合2019-nCoV的S蛋⽩，從⽽構建更⼩的ACE2-Fc蛋⽩。雖然我們尚不知道2019-nCoV S蛋⽩的結構或其與ACE2受體的結合⽅式，但現在可以合理地假設 SARS 病毒利⽤的 ACE2 蛋⽩結構域同樣的也被2019-nCoV結合從⽽感染細胞。

        Fc結構域的優勢是延長了藥物的半衰期，這可以使醫護⼈員在見到感染患者之前可以預防性地給予藥物劑量，達到預防感染的⽬的。與先前的阻斷劑策略的不同之處在於，Fc 結構域功能尚存，從⽽允許通過 CD16 激活樹突狀細胞，巨噬細胞和⾃然殺傷細胞來抵抗病毒顆粒感染細胞。這可能有助於更快地激活宿主抗病毒免疫反應並消除病毒， 這在 SARS ⼩⿏模型中得到了證明，與僅中和病毒的抗體相⽐，與 Fc 結合的抗體通過吞噬細胞的激活在消除 SARS ⽅⾯更為有效。 總體⽽⾔，ACE2-Fc 融合蛋⽩將具有與傳統中和抗體相同的許多好處，可以尋求作為治療感染的⼿段，但是由於相同的蛋⽩質 ACE2 也是病毒進⼊細胞的受體， 2019-nCoV ⽆法逃避其中和作⽤，因此它具有最⼤的⼴度和效⼒。

        為了進⼀步⽀持受體-免疫粘附蛋⽩作為潛在抗病毒策略的潛⼒，值得⼀提的是CD4-Fc 或 CD4-IgG 是發展為潛在 HIV 藥物的早期藥物之⼀。 該蛋⽩質包含 CD4受體的前兩個結構域，已知與感染的 HIV 細胞表⾯上的 gp120 結合。已顯⽰ CD4-IgG 可在體外中和 HIV 防⽌感染。盡管隻有有限的臨床獲益，但該蛋⽩質在患者中給藥仍是安全的。已開發出更新的 CD4-IgG 增強版本具有衍⽣共受體CCR5 的⼩肽，可增強親和⼒並提供更有效的中和活性，基本上可分離 100%的HIV，並使獼猴對多次猿猴抗性-⼈免疫缺陷病毒感染具有免疫⼒。 雖然 HIV和2019-nCoV是⾮常不同的病毒，具有不同的細胞類型， 動⼒學和臨床過程，但先前的 HIV 結果令⼈⿎舞， 這可能是 2019-nCoV 的有效治療策略。2019-nCoV 可能更適合這種中和療法，因為與 HIV 不同，HIV 會在具有不同宿主細胞中引起慢性感染，⽽呼吸道病毒引起的是急性感染。

        ACE2-Fc 策略的⼀個潛在局限性是細胞外 ACE2 ⽔平的增加可能對⼈體產⽣未知的影響。

        ⼈體組織已經分泌了少量的細胞外 ACE2，因此該細胞外結構域進⼊⾎液循環並是前所未有的。SARS 病毒與 ACE255 的肽酶結構域結合，可以預見將肽酶活性相關的關鍵氨基酸進⾏突變可以廢除該序列的天然功能，同時保持對 SARS 和2019-nCoV 的⾼親和⼒。前期研究已經在⽣成 ACE2 和 IgG1 融合蛋⽩中嚐試了這種可能性，該蛋⽩表明 ACE2 細胞外域的 374 和 378 位的組氨酸殘基突變消除了肽酶活性，但保留了與 SARS 的 S 蛋⽩的⾼親和⼒結合。因此建議在將來治療2019-nCoV 患者時尋求⼀個突變的 ACE2 結構域，以避免任何副作⽤(圖 2B)。

        另⼀個潛在的擔憂是，通過抗體形式的受體結合可能會⽆意中將 2019-nCoV 導向感染 Fc 受體(CD16)陽性細胞，這已在 MERS32 中和抗體的體外實驗中被報道。⽬前尚不清楚這將具有什麼臨床意義，以及在體內將在多⼤程度上發⽣。最終，仍需要臨床試驗來發現 ACE2-Fc 治療的任何特定副作⽤。