摘要

        骨頭具有損傷後自修複功能，可是，大規模複雜斷裂可能會超出骨頭的自然修複承受力，導致骨不連，需要外加幹預來促進骨再生。移植組織工程製造的骨頭是一種非常有潛力的治療方法，但目前主要采用的是膜內成骨(由成骨細胞成骨)，然而大多數嚴重的骨損傷修複機製為軟骨成骨(軟骨基質增厚重新塑性成骨)。幹細胞分化為肥大軟骨細胞，這是軟骨硬化成骨的重要一步，但一直以來沒有被研究者開發用於長的骨缺陷修複。基於此，Gordana Vunjak-Novakovic課題組研發了以人類脂肪幹細胞(ASC)為原料的組織工程移植體，這一工作於2017年5月發表於Biomaterials[1]。ASC是一種臨床上可用的細胞源，可以分化成肥大軟骨細胞，生長在脫細胞骨支架上，然後移植到有骨缺陷的無胸腺大鼠身上。實驗表明這種移植體在大鼠體內發生了軟骨骨化，表明將ASC衍生的肥大軟骨細胞接種在骨支架上，有助於長骨修複。

        背景介紹

        據估計，在美國每年有十萬例病人遭受自身修複能力難以承受的骨折，並且沒有得到治愈[2]。想要有效治愈骨不連，就需要外加幹預，很多時候會進行骨移植手術。在移植手術中，自體移植物和異體移植物相比，能夠促進創傷愈合成骨，需要重新手術修正的比例也小得多。盡管自體移植有很多好處，然而在臨床上用的很少，這主要是因為缺乏適合的自體骨。於是研究人員想到了利用病患的幹細胞培養自體移植骨，而不是從病患體內取別的骨頭進行移植[3]。然而這種方法在長骨修複的病例中治療結果喜憂參半。

        我們的身體在進行長骨修複的過程中，利用的是軟骨骨化。此過程起始於間葉幹細胞形成軟骨基質，進一步這種細胞分化為成熟的肥大軟骨細胞，使得軟骨基質變為骨模板，誘導脈管係統和骨髓形成[4]。由於自體移植有如此的優越性，同時以往的細胞加生長因子療法又有許多局限性，本研究的目標是製造一種可臨床使用，可控並且可再生的長骨修複組織。

        實驗方法

        首先製備脫細胞支架。從幼體牛腰部取出骨小梁，切成直徑4毫米高度6毫米的圓柱體。選取疏鬆程度相近的骨質，用多種溶液灌流，再用蛋白質酶、DNA酶和RNA酶溶液處理，去除原生細胞，得到脫細胞支架。

        然後將細胞回植到脫細胞支架中。從病患體內獲得脂肪組織並提取出脂肪幹細胞。細胞在培養基中擴增，將先前製得的脫細胞支架在70%乙醇中浸泡兩天，然後在無菌培養基中浸泡一天。將脂肪幹細胞從培養皿中消化下來，植入幹燥後的脫細胞支架中。

        接著將栽種了細胞的支架在擴增培養基中培養2天，使得細胞能夠貼附，繼續添加誘導分化物和生長因子，使幹細胞分化成熟，並且增殖形成實驗組移植物，培養過程為5周。而對照組移植物則是在乙醇中浸泡了兩天後儲存在磷酸鹽緩衝液中的脫細胞支架，5周後同時進行移植手術。

        本實驗用到的是無胸腺(免疫係統缺陷)大鼠，將其麻醉後在右側股骨頭用線鋸製造一個5mm長的創口，將製備好的移植物植入創口處並縫合。另有4隻大鼠沒有植入移植物，以觀察不愈合骨損傷帶來的影響。

        實驗結果

        向培養基中添加誘導因子，使得骨支架中的脂肪幹細胞分化成為肥大軟骨細胞和成骨細胞。靜態培養(H組)是通過幹細胞與軟骨組織共培養誘導分化(2周)，然後加入生長因子使細胞增厚成熟(3周)。另一組(O組)采用了間隙流動方式使幹細胞分化為成骨細胞。

        在五周的培養過程後，H組表現出了類似軟骨組織的性質，軟骨細胞和肥大軟骨細胞相關基因表達上調，表達量高於O組(圖2.A)，類骨質和組織基質(圖2.B黑色箭頭指向處，在黃色細胞支架上表現為紅色)在所製備的移植體上形成，並且O組的類骨質沉積要比H組多。然而肥大軟骨細胞在支架上的軟骨基質中的沉積，H組更多，分布更廣，在膠原基質上的沉積量也更多。(圖2.C綠色為軟骨素中的糖胺聚糖，紅色為膠原蛋白纖維)骨唾液蛋白(BSP)，作為骨頭礦物化過程的重要因子，在移植物中的沉積分布與基質性質相吻合：H組中分布在軟骨組織附近，而O組中分布在膠原纖維附近。(圖2.D)骨橋蛋白，另一種成骨過程中的重要蛋白，在H組中同樣可以在軟骨基質附近找到，然而在O組中幾乎找不到。因此在培養完成移植時，H組移植物與O組相比，已經有更高的骨相關基因表達量，成骨相關蛋白也更多。

        移植手術後3周，H組移植物已經開始和原生骨相容，並且有大量礦物質沉積，然而O組隻有少量骨相容，並沒有發現礦物質沉積。Con為沒有回植細胞的脫細胞支架對照組。6周後差異更加明顯，H組移植物與兩端骨相容的部分增加，然而O組隻在端部有少量相容，對照組的礦物沉積更多了，然而表現為碎片化，隻有很少量的骨質在脫細胞支架和缺陷處形成。12周之後，H組骨連接達到了原缺陷的7/8，而對照組為3/8，O組隻有1/8。

        骨質形成與再生。A.新生骨質(NB)標記為桃紅色，植入的細胞支架(DCB)標記為淺粉色，纖維組織(FT)為黃色。B.將視野放大後可以看到骨髓(BM)，標記為藍色，鈣化的軟骨組織(CC，深紫色)。C.軟骨組織染為綠色，新骨為黃色，在三組中都發生了軟骨鈣化。

        在O組和對照組中，原生股骨頭邊緣發生了軟骨鈣化，而在H組中，這一現象可以在整個移植體中觀察到。H組中鈣化的軟組織和形成的骨髓都多餘於兩組，而纖維化組織更少，表明了骨再生程度高。

        討論與總結

        自體移植骨的組織工程研究對於創傷後骨不連有很好的修複潛力，針對不同病患的各種骨缺陷可以采取個性化治療方法。然而現有臨床治療方案都有一些缺陷，例如骨相容程度差、無法完全再生、移植物力學強度不夠等等[5]。本研究認為利用分化得到的肥大軟骨細胞植入細胞支架可以克服這些問題。上文中已經說明，這種方案製備的移植物優越性主要體現在：1.能和原生骨很好相容;2.骨質沉積量更大;3.能夠更加有效愈合骨缺陷;4.在骨缺陷周圍空間形成再生環境。