膠質母細胞瘤(Glioblastoma，GBM)是一種侵襲性中樞神經係統(central nervous system，CNS)疾病，每年10萬成年人中約2~3 人發病，每年造成美國14 000 多人死亡。GBM患者存活時間很少超過15個月，在過去的20年裏，這個數字幾乎沒有變化。它的病死率是所有惡性原發性腦瘤中最高的，通過標準治療，平均生存率為14個月。目前GBM患者的標準治療方法是腫瘤切除後放療和/或基於替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)的化療。

        TMZ 是FDA 批準的口服烷基化藥物，可穿越血腦屏障(blood brain barrier，BBB)，一旦進入細胞核，即可將甲基轉移至雙鏈DNA 誘導甲基DNA 複合物中的嘌呤堿基上。這種DNA複合物誘導DNA形成缺口，導致細胞周期停滯和凋亡。DNA修複酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methyl-guanine DNA methyltransferase，MGMT)的過度激活可導致GBM患者對TMZ的耐藥。

        實際上，TMZ化學療法的一大缺點是大約90%的GBM患者會產生耐藥性，並且對第二輪TMZ治療無反應。報告顯示，TMZ僅可使GBM患者的總生存期增加2.5個月。其他研究表明，當前的治療標準、手術、TMZ和放療以及其他藥物(如貝伐單抗)的聯合治療並未顯示患者的總體生存率有改善。

        腫瘤本身以及目前的治療方法對大腦的持續損害，會在患者生存時造成身體衰弱、神經認知和心理上的後遺症。顯然，現有的治療方案是不太理想的，需要對這些腫瘤的生物學有更深入的了解，以改進治療方法。

1.GBM中內質網應激

        真核生物的內質網(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質合成和折疊、脂質合成、化合物排毒、葡萄糖代謝和鈣存儲的主要場所。此外，內質網中存在的伴侶蛋白、折疊酶和翻譯後修飾蛋白介導新生的跨膜蛋白和分泌蛋白適當折疊成其天然構象，然後進行組裝。

        ER還具有質量控製機製，僅輸出正確折疊的蛋白質，而末端錯誤折疊的蛋白質則通過稱為ER 相關降解(ER-associated degradation，ERAD)的過程降解。然而，在疾病條件下，或由於微環境、溫度和活性氧的變化，或由於化合物導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)升高，內質網維持重要細胞功能的穩態經常受到幹擾。在這些情況下，反應主要是由錯誤折疊或未折疊蛋白質的積累引起的，這個過程也被稱為未折疊蛋白反應(unfolded proteinreaction，UPR)。此外，已知有多種藥物製劑可以觸發ERS;例如Thapsigargin，它幹擾鈣穩態;Tunicamycin，阻斷蛋白糖基化。

        ERS可在多種實體腫瘤樣本(如膠質瘤)中觀察到，研究表明其與調節腫瘤化學敏感性密切相關。ERS標誌物78 kDa 葡萄糖調節蛋白(78 kDa glucose regulated protein，GRP78)在正常腦組織中的表達低於其他正常組織，但在GBM中表達高於其他腫瘤。在膠質瘤等腫瘤細胞係模型中的多項研究表明，ERS相關蛋白如GRP78/免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)、轉錄激活因子(activatingtranscription factor，ATF)4、ATF6、脯氨酰4-羥化酶β多肽(prolyl 4-hydroxylase，beta polypeptide，P4HB)等具有促生存作用，並作為化療耐藥相關因子發揮作用。

2.ERS和非折疊蛋白反應

        當未折疊或錯誤折疊的蛋白質在ER內腔中積聚時，就會激活特定的ER應激途徑，稱為未折疊蛋白質反應(unfolded protein response，UPR)。UPR 由3個主要傳感器控製：Ire1同係物(Ire1 homologs，IREs)，雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)樣內質網激酶[double-stranded RNAdependentprotein kinase(PKR)-like ER kinase，PERK]和ATF6。當ER蛋白的折疊能力因細胞需求和(/ 或)細胞能量利用率不足而無法正確折疊合成到ER中的蛋白時，錯誤折疊的蛋白會積聚。

        當應激持續或過於嚴重時，UPR啟動凋亡過程以消除受損細胞。這表明，UPR決定細胞的生存和死亡取決於應激強度和持續時間。從本質上講，ERS反應的原理將被簡化為該過程中2個中央執行蛋白的活性，即GRP78/BiP和CCAAT/增強子結合蛋白質同源蛋白[CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP)homologous protein，CHOP]，也稱為生長停滯和DNA損傷誘導基因153(growth arrest and DNA damage inducible153，GADD153)。雖然有更多的成分參與ERS的控製，但GRP78和CHOP在這些事件中起決定性作用。

        GRP78是一種被葡萄糖水平降低強烈誘導表達的蛋白。作為內質網駐留蛋白，它可以充當分子伴侶以支持正確的蛋白質折疊，將錯誤折疊的蛋白質靶向降解，並充當鈣結合蛋白。重要的是，GRP78能夠結合並抑製上述ERS通路PERK、IRE1和ATF6這3個調控因子的活性，從而在促生存過程中發揮主調控功能。

        另一方麵，CHOP通過抑製抗凋亡Bcl-2，刺激死亡受體5(DR5)的表達，激活Caspases(程序性細胞死亡的“劊子手”蛋白)，是ERS反應中促凋亡過程中的關鍵執行者。GRP78水平升高對細胞具有保護作用，可恢複和維持ER穩態，而CHOP水平持續升高則拮抗這些作用，並在應激過強且無法解決的情況下使細胞趨於凋亡。

        一般來說，正常細胞和組織不會受到ERS的影響，因此GRP78的表達量非常有限，CHOP的表達水平也低於檢測限。正常細胞隻有在故意暴露於應激條件下，如低血糖、嚴重缺氧或使用Thapsigargin等藥物治療後才會增加GRP78和CHOP的合成。暴露的長度和嚴重程度決定了CHOP的表達程度，而CHOP的表達程度又決定了細胞的最終結局，即適應與細胞死亡。

        細胞無法長期耐受升高的CHOP水平，GRP78的促生存功能之一是將CHOP水平降低至應激前狀態並保持其柔和狀態。因此，由於其控製的嚐試時間較短，CHOP表達水平可以作為一種方便的讀數來揭示ERS的急性期。在中等應激條件下，GRP78通過與內質網跨膜信號成分PERK、IRE1和ATF6結合並抑製CHOP表達。但是，當壓力過大或過長時，大多數GRP78分子會忙於修複內腔中錯折疊的蛋白質，因此無法限製這些跨膜蛋白質的活性，從而導致高水平的持續表達CHOP並因此導致細胞死亡。

        與正常細胞相比，腫瘤細胞經常麵臨應激性挑戰，這些細胞的新陳代謝需求增加，以及永久性的生理變化，如Warburg效應和腫瘤特異性丙酮酸激酶異構體的表達，可能會加劇應激性挑戰。在細胞應對和適應這些變化的努力中，促生存成分GRP78的表達增加，而在癌細胞和腫瘤組織中確實經常檢測到GRP78的水平升高，通常被認為是這些細胞ERS基線水平長期升高的指標。

        綜上所述，GRP78支持腫瘤細胞在低氧、低血糖、酸性等亞優微環境條件下的增殖和生存，並減輕了細胞因蛋白質合成增強而對蛋白質折疊的需求。GRP78的保護功能還包括抑製促凋亡通路，其中包括CHOP的抑製。直接的結果是，許多具有高GRP78水平的腫瘤細胞顯示出對某些類型化學療法的耐藥性增加，例如阿黴素，這可能解釋了腫瘤組織中GRP78染色強陽性的癌症患者的預後不良。然而，盡管慢性ERS和永久升高的GRP78水平似乎為腫瘤細胞提供了生存優勢，但這種表型將腫瘤細胞與正常細胞區分開來，因此可能為針對這種應激係統的治療幹預提供了機會。

3.GBM和UPR

        在癌症中，最初人們認為UPR主要是作為一種支持腫瘤細胞存活的適應係統。然而，近年來人們認識到UPR，尤其是激活轉錄因子ATF4、X 盒結合蛋白(X-boxbinding ，XBP1)和ATF6在腫瘤發育過程中基因表達重編程中的重要作用。

        3.1 UPR 和GBM 腫瘤發生

        UPR直接參與膠質發育的研究很少。到目前為止，隻有IRE1編碼基因ERN1的體細胞突變被報道可能代表腫瘤(包括GBM)的驅動突變。然而，在GBM中ERN1突變非常罕見(頻率<1%)，可能在膠質發育中沒有重要作用。此外，IRE1在膠質發育中的功能參與尚未被證實。在其他研究中，ERS相關基因表達的變化與GBM的發展有關。例如，對GBM患者樣本基因拷貝數變化的基因組分析顯示，在染色體7p11.2處有很強的擴增，可以確定為SEC61c 和EGFR 基因。

        ERS 與GBM 幹細胞(Glioma stem cell，GSC)的自我更新特性之間存在聯係。GBM被認為起源於GSC，GSC也與GBM的侵襲性特征相關，例如高腫瘤血管化，侵襲行為，化學和放射抗性以及手術後疾病複發。GSCs具有自我更新能力和較高的腫瘤啟動潛能，並能分化為大體積腫瘤細胞，這些大體積腫瘤細胞通常被認為缺乏或降低了腫瘤形成能力。通過在小鼠GBM模型中采用體內RNAi 篩選方法，發現表觀遺傳修飾多聚組蛋白BMI1 通過影響轉化生長因子β/骨形成蛋白(TGF- β/BMP)通路和ERS通路發揮其功能。

        兩種途徑都可能與各種基因的表達降低和功能改變有關，包括ATF3。ATF3是p53的下遊靶標，已參與UPR信號傳導，特別是PERK分支。在小鼠GBM模型中發現ATF3的表達被BMI1抑製，並與增強的幹性有關。同時發現在GBM患者樣品中，ATF3低表達時與患者預後不良相關，基於這些結果，我們提出了ATF3可能作為腫瘤抑製基因在GBM中起到一定的作用。

        3.2 UPR 和GBM 腫瘤進展

        UPR在GBM腫瘤進展中的作用已得到更深的探討。DROGAT等首次證明，在U87 GBM細胞係中過表達顯性陰性(dn)IRE1可抑製缺氧或葡萄糖剝奪誘導的血管內皮生長因子A(VEGFA)表達。特別是，已發現ATF4/XBP1和HIF1/XBP1異二聚體可轉錄激活包括血管內皮生長因子(VEGF)在內的促血管生成基因的表達。

        通過對小鼠原位顱內植入術中U87對照或IRE1缺陷細胞的腫瘤生長情況進行評估，發現IRE1(dn)細胞產生的腫瘤小，並伴有血管化減少，進一步證實了VEGFA在IRE1適應性信號傳導中的重要性。在後續研究中發現IRE1確實是U87模型中血管生成和侵襲的關鍵調節因子。使用類似的方法，IRE1信號因U87細胞中IRE1的過表達而受損，與U87對照腫瘤相比，顱內植入後觀察到腫瘤的生長減少和侵襲增加。

        另外，在U87(dn)腫瘤中檢測到腫瘤血管形成減少，這也可以在雞蛋血管生成測定中得到證實。轉錄譜的比較顯示，U87(dn)細胞中IL-1β，IL-6，IL-8和VEGFA降低。這些細胞中白介素-6(IL-6)的過量表達可促進血管形成。此外，在IRE1 受損的U87 細胞中，星形細胞瘤細胞遷移的重要調節劑半胱氨酸酸性分泌蛋白(SPARC)的上調與間充質標誌物表達的增加有關。這些發現共同表明，與正常組織相比，GBM中的UPR活性提高，並有助於GBM的發展。這為設計新的UPR靶向策略和開發新的治療方法提供了一個治療窗口。

4.總結與展望

        盡管尚未證明UPR直接參與神經膠質瘤的發生，但上述研究表明，UPR在GBM的生長和進展中起著重要的作用。UPR整合了不同的細胞過程，從蛋白質折疊到轉錄和翻譯的控製，從蛋白質降解到調控細胞命運的信號通路。UPR的慢性活化是腫瘤細胞的一種普遍特征，被認為是抑製腫瘤細胞增殖遷移、抗凋亡和抗腫瘤藥物的機製之一。

        傳統上，UPR被認為是一種有利於生存的適應機製，旨在降低未折疊蛋白水平和恢複內質網平衡。盡管這可能是正確的，尤其是在腫瘤發生的早期階段，但癌細胞顯然已經以多種方式共同采用了UPR，從而有利於其進展和轉移。

        事實上，這種複雜網絡的激活代表了致癌轉化過程中的重要一步，並影響了GBM 的多個標誌，包括耐藥性。因此，ERS/UPR調節劑對於傳統化療或其他靶向治療失敗的患者似乎是很有前途的藥物。然而，UPR對細胞命運的雙重影響強烈表明，針對這種複雜網絡的治療靶標需要全麵了解決定UPR促進細胞死亡或存活的確切機製。

        另外，筆者前期研究發現ERS誘導劑衣黴素可以通過抑製CD47和EGFR等膜蛋白表達，抑製膠質瘤細胞的增殖能力及遷移能力並最終抑製膠質瘤的發生，預示著靶向ERS有望進一步增強免疫治療的療效。但未來麵臨挑戰眾多，例如ERS導致的CD47和EGFR的信號變化對膠質瘤細胞功能的影響、ERS是否可以抑製膜蛋白的表達從而抑製腫瘤的發生發展、ERS調控機製、衣黴素結合化療手段(卡鉑)的給藥劑量和頻率，以及可能最重要的需要解決的是GBM的分子異質性等，尚待進一步研究。

        GBM表現出了強大的應激抵抗和抗凋亡生存機製的特征。也許我們的治療工作應著重於動搖壓力反應的基礎。然而，ERS誘導劑治療的臨床效益仍有待進一步研究。與其使用具有多效性的天然產物，不如開發和測試特異性的UPR分支靶向分子，以檢驗UPR作為治療GBM患者的有希望的靶點的潛力。

        來源：楊順,袁盾,劉鬆林,李毅鋒.內質網應激/未折疊蛋白反應在抑製腦膠質母細胞瘤中的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜誌,2021,48(03):284-288.