近年來，基因測序的臨床應用使血液腫瘤的診治趨於精準化，某些基因如激酶類突變、轉錄因子突變、表觀遺傳類突變的存在不但可以幫助確定治療方案，還有助於預測藥物療效。

        與成功實現大規模前瞻性實體瘤分子分析的工作流程不同，對血液腫瘤體細胞突變的評估存在獨特的挑戰，例如缺乏可操作的與患者匹配的正常對照，影響變異等位基因頻率(VAF)的拷貝數改變經常發生，因此該指標無法可靠地區分體細胞起源與胚係起源。

        近日，美國紀念斯隆-凱特琳癌症中心(MSKCC)研究團隊通過展示MSK-IMPACT Heme的開發和臨床經驗分享了應對上述獨特挑戰的經驗。MSK-IMPACT Heme是針對血液腫瘤可操作靶點的綜合突變譜，是通過基於雜交捕獲和高覆蓋率的NGS分析平台獲得的腫瘤和匹配正常DNA獲得體細胞突變的綜合數據集。

        結果表明，對腫瘤和匹配的正常樣本進行大規模測序在血液腫瘤中是可行的，可用於指導血液腫瘤患者的診斷、預後、治療選擇和未來監測。該成果已發表在Nature Communications上，文章題為“Enhanced clinical assessment of hematologic malignancies through routine paired tumor and normal sequencing”。

        不同胚係標誌物的前瞻性臨床測序及應用

        研究團隊開發了MSK-IMPACT Heme以靶向400個已知參與血液腫瘤病理生物學的基因，這些基因被用於血液腫瘤的診斷和預後，並且是實驗性或已批準治療藥物的靶點。為了準確地識別血液腫瘤的體細胞突變，研究人員使用唾液和指甲作為胚係DNA來源(圖1a)。在一係列等位基因頻率(範圍0.02-0.97)內，該突變檢測對113個樣本中的278個已知突變具有100%的敏感性和100%的特異性。

        研究團隊對來自1937名患者的2383個腫瘤樣本進行了測序，涉及85種不同的血液腫瘤(圖1b)。其中，1602份(67%)與指甲DNA匹配，664份(28%)與唾液DNA匹配，27份(1%)與兩者都匹配。對於同種異體幹細胞移植後進行測序來自48例患者的67個(3%)樣本，來自非腫瘤組織的宿主和供體DNA都被測序作為比較(圖1d)。

        研究人員根據疾病形態觀察到唾液和指甲中不同水平的體細胞腫瘤突變。在指甲樣本中檢測到的突變幾乎在所有病例中都發現了高腫瘤:指甲VAF比率(中位數為8;範圍為1.5-38)，支持了指甲對照樣本用於破譯腫瘤患者樣本中檢測到的胚係與體細胞變異具有一定效用，唾液在髓係腫瘤中作為胚係對照的作用有限(圖1e-g)。

        使用宿主和供體正常對照識別移植環境中的體細胞突變

        為了識別具有預後和診斷意義的小型和大規模體細胞拷貝數改變(SCNA)，研究人員開發了一種算法(FACETS2n)，該算法利用來自患者不匹配正常樣本的覆蓋數據，並結合患者匹配的等位基因頻率來估計integer水平的拷貝數以及等位基因失衡(如拷貝中性雜合性缺失cnLOH)。來自64個臨床樣本的MSK-IMPACT Heme FACETS2n分析具有92.9%的敏感性和100%的特異性，與高密度單核苷酸多態性(SNP)陣列分析結果高度一致。

        為了進一步證明使用宿主和供體正常組織進行統一分析的實用性，研究團隊報道了一例接受異基因幹細胞移植治療的37歲急性髓係白血病患者。研究人員對該患者的複發骨髓進行了MSK-IMPACT Heme分析，發現能夠在嵌合患者中準確區分所有宿主和供體多態性與體細胞突變，其中宿主和供體衍生多態性的VAF範圍與真正的體細胞突變重疊(圖2a)。

        除了去除背景多態性外，使用FACETS2n還可以在移植後環境中進行更複雜的局部拷貝數分析。研究人員使用來自患者指甲和供體血液的DNA作為移植後骨髓活檢的基線樣本對照，檢測到13號染色體q臂的cnLOH(圖2b)。此外，研究人員還證明了使用MSK-IMPACT Heme分析流式細胞分選樣本的實用性。

        體細胞基因組圖譜

        研究團隊從2290份樣本中鑒定出12893個體細胞突變，4231個基因水平和7566個broad染色體臂水平的體細胞拷貝數改變。MSK-IMPACT Heme工作流程的實施使複雜腫瘤樣本的表征成為可能，包括流動分選樣本和嵌合移植後患者的腫瘤樣本。1937例患者中有1885例(97.3%)發現體細胞基因組突變，包括非同義SNV、Indel和染色體臂水平拷貝數改變等。

        除了基因水平的拷貝數改變外，FACETS2n還能準確評估等位基因特異性拷貝數狀態，包括CN-LOH。CN-LOH在433個樣本中被發現(19%)。研究還在單個腫瘤樣本中發現含有多個體細胞突變的基因，這可能反映了雙等位基因失活、多個亞克隆或異常的體細胞超突變。

        突變特征

        與實體瘤相比，血液腫瘤往往具有較低的體細胞突變水平，這可能是患者對免疫檢查點抑製反應相對令人失望的原因。在MSK-IMPACT Heme分析中，研究人員計算了所有樣本的腫瘤突變負荷(TMB)(圖4a)。與髓係惡性腫瘤相比，淋巴係腫瘤的TMB更高。研究發現，腫瘤的突變過程可歸因於激活誘導的胞苷脫氨酶(AID)活性、錯配修複(MMR)缺陷、紫外線照射(UV)、化療等(圖4b)。

        研究顯示，通過使用匹配的正常個體識別體細胞改變，可以更準確地評估這些腫瘤中的TMB，展示了TMB升高的血液腫瘤靶向測序的突變特征分析能力，有助於確定潛在的突變過程，並有可能利用這些數據影響患者管理。

        臨床可操作性

        研究人員還進一步評估了前瞻性分子譜分析的臨床應用，以指導使用OncoKB數據庫進行患者管理。OncoKB的證據水平係統可根據證據水平注釋基因突變，這些突變或者是藥物敏感性的預測生物標誌物，或者對診斷或預後具有重要意義。研究團隊基於在樣本中檢測到突變的最高水平證據對患者樣本進行分類，發現10.6%的患者至少有一個潛在的臨床可操作突變，71.5%存在致癌突變(圖5a)，43%患者至少有一個具有診斷或預後意義的突變。這一分析反映了該隊列在疾病水平上的可操作性被低估，因為MSK-IMPACT Heme分析不包括可操作基因融合或重排的靶標檢測，這些靶標可能在未來的panel設計迭代中得到解決。

        將MSK-IMPACT Heme檢測到的體細胞拷貝數改變與常規核型(G-banding)和FISH相結合，可以更靈敏地檢測拷貝數改變。研究還證明了利用MSK-IMPACT Heme隊列區分SF3B1改變患者亞組的能力(圖5c)。通過對匹配正常組織中的候選突變進行基因分型，從報告中去除胚係突變，能夠更好地識別用於MRD評估的適當標誌物，並防止假陽性結果。

        該研究報告了大規模的前瞻性臨床測序工作的經驗，有助於指導血液腫瘤患者的診斷、預後、治療選擇和未來監測。研究表明，腫瘤和匹配正常樣本的大規模測序在血液腫瘤中是可行的，包括造血幹細胞移植後的患者和患有多種並發惡性腫瘤的患者。這一流程的周轉時間是可變的，在該隊列中通常為2-3周。根據獲取腫瘤-正常匹配的時間框架，可能會縮短周轉時間，進一步強調了多學科方法對於工作流程優化的重要性。

        研究人員相信，隨著持續的研究和數據共享，廣泛的基因組評估將支持了解所有血液腫瘤患者的病理生物學，確定新的藥物靶點，並改善無創監測。

        該研究全部數據集共享在cBioPortal：https://www.cbioportal.org/study?id=heme_msk_impact_2022.

        論文原文：

        Ptashkin, R.N., Ewalt, M.D., Jayakumaran, G.et al.Enhanced clinical assessment of hematologic malignancies through routine paired tumor and normal sequencing.Nat Commun14, 6895 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42585-9