近二十年，隨著免疫檢查點的不斷挖掘，腫瘤免疫的研究突飛猛進，人們發現腫瘤細胞能表達PD-L1，與T細胞的PD-1結合，激活免疫抑製信號，從而逃逸腫瘤免疫。目前，靶向腫瘤細胞的PD-L1抑製劑，已經是行之成效的腫瘤治療策略。

        然而，當前PD-L1的靶向治療存在個體反應差異大和耐藥等缺點，導致現有的PD-L1抑製劑療效差強人意[1]。因此，深入研究PD-L1的表達調控機製，對於增強PD-L1阻斷療效、抑製腫瘤細胞免疫逃逸至關重要。

        有研究發現，腫瘤細胞PD-L1的表達與NF-κB的過度激活密切相關[2]。在經典的信號通路中，NF-κB蛋白被IκBα蛋白結合而受到抑製，在IκBα經磷酸化和泛素化被蛋白酶體降解後，NF-κB得以釋放並轉運入細胞核，誘導PD-L1等靶基因表達。

        腫瘤細胞在富含營養的微環境中生長，其增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為受到營養物質調控。但是腫瘤微環境中的營養物質，特別是葡萄糖，是否會影響腫瘤細胞免疫逃逸，目前尚有待深入研究。

        近日，浙江大學呂誌民課題組發現，葡萄糖能誘導腫瘤細胞上調PD-L1表達。具體來說，糖酵解的關鍵酶HK2磷酸化IκBα，促進IκBα降解，從而激活NF-κB通路，進而促進PD-L1表達和腫瘤免疫逃逸。相關論文發表於頂級期刊Cell Metabolism上[3]。

        論文首頁截圖

        首先，研究人員使用葡萄糖處理膠質母細胞瘤等多種腫瘤細胞，發現無論是低氧還是常氧條件，PD-L1的表達都隨葡萄糖濃度的提高而增加，而轉錄抑製劑能抵消葡萄糖的促PD-L1表達作用，這表明葡萄糖經糖酵解在轉錄水平對腫瘤細胞表達PD-L1進行了調節。

        HK2位於線粒體外膜，是葡萄糖進行糖酵解的第一個限速酶，把葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖(G6P)[4]。既往研究發現腫瘤組織糖酵解活躍，HK2過表達[5]。研究人員敲除了腫瘤細胞的HK2，發現即使給予葡萄糖或G6P刺激，PD-L1表達依舊減少，表明HK2是葡萄糖誘導PD-L1表達的關鍵。

        研究人員對HK2介導PD-L1表達的機製進行了探究。

        之前的研究表明，HK2的產物G6P能解救HK2從線粒體釋放至細胞質[6]，免疫共沉澱實驗發現HK2在細胞質中與IκBα結合，其結合被G6P促進，提示除糖酵解作用外，HK2還通過其他方式調控腫瘤細胞，而這種調控受到糖酵解影響。

        既然HK2能磷酸化葡萄糖，那是否對IκBα也有激酶活性?

        激酶實驗發現HK2在T291位點磷酸化IκBα，葡萄糖和G6P能提高其磷酸化作用，表明糖酵解不僅促進HK2結合IκBα，還促進HK2磷酸化IκBα T291。

        然而，與IκBα在T291位點磷酸化水平相反的是，腫瘤細胞經葡萄糖刺激後，IκBα表達竟然降低。這提示HK2介導的IκBα磷酸化負性調節了IκBα的表達，進一步的實驗證實IκBα T291被HK2磷酸化後在蛋白層麵促進了IκBα降解。

        那麼，IκBα蛋白在磷酸化後又是通過何種方式被降解的呢?

        除經典的由IKK激酶介導的磷酸化後泛素-蛋白酶體降解途徑外[7]，IκBα還能與蛋白酶μ-calpain結合並被降解[8]。研究人員對這兩種方式分別進行了檢測。

        IKK磷酸化IκBα的位點在S32和S36，不在T291，而且T291突變不改變IκBα泛素化水平，提示HK2促進IκBα降解的機製不是泛素-蛋白酶體;蛋白結合實驗發現IκBα T291磷酸化後與μ-calpain的結合增多，抑製μ-calpain能提高T291磷酸化的IκBα蛋白含量。這些結果表明，IκBα經HK2磷酸化後與μ-calpain結合被降解。

        IκBα是NF-κB信號通路的抑製蛋白，IκBα的降解意味著NF-κB信號的激活。研究人員對腫瘤細胞的NF-κB和PD-L1進行了檢測，發現過表達HK2，IκBα蛋白減少，NF-kB入核增多，PD-L1表達上調。糖酵解通過HK2磷酸化IκBα促進降解，激活NF-κB上調PD-L1表達。

        HK2經G6P協助脫離線粒體後結合並磷酸化IκBα促進其降解，激活NF-κB上調PD-L1表達

        接著，研究人員在體外檢測了腫瘤細胞HK2/IκBα對T細胞的影響。他們將CD8+T細胞和腫瘤細胞共培養，發現在腫瘤細胞的HK2離開線粒體磷酸化IκBα後，CD8+T細胞γ幹擾素產生減少，而在腫瘤細胞IκBα T291位點突變喪失磷酸化後，CD8+T細胞γ幹擾素的生成抑製被解除。這說明HK2介導的IκBα T291磷酸化能抑製CD8+T細胞活化。

        然後，研究人員在體內驗證了HK2/IκBα在腫瘤發生和免疫逃逸中的作用。腦膠質瘤小鼠在HK2過表達後腫瘤更大，生存期更短，HK2和IκBα的結合增多，IκBα T291磷酸化上調，IκBα蛋白水平降低，PD-L1表達增加，CD8+T細胞浸潤減少。

        而在IκBα T291位點突變後，腦膠質瘤小鼠的腫瘤縮小，生存期延長，PD-L1水平降低，CD8+T細胞浸潤和顆粒酶B表達增加。這些結果表明，HK2介導的IκBα T291磷酸化，減少了CD8+T細胞在腫瘤中的浸潤和激活，以及隨後的腫瘤免疫逃避。

        最後，研究人員在腦膠質瘤中對靶向HK2的治療進行了探索。他們發現HK2抑製劑和抗PD-1抗體聯用，比單藥更能抑製小鼠腫瘤生長，延長生存期，強烈抑製HK2介導的IκBα T291磷酸化和PD-1表達，顯著提高CD8+T細胞在瘤體內的浸潤和顆粒酶B表達，提示聯合HK2抑製劑和免疫檢查點阻斷的療法能消除腫瘤免疫逃避。

        HK2過表達的腦膠質瘤小鼠腫瘤更大，生存期更短

        此外，研究人員還通過自收樣本並結合線上數據庫，對HK2調控PD-L1表達的臨床意義進行了驗證。在腦膠質細胞瘤中，HK2 mRNA水平與IκBα T291磷酸化水平和PD-L1 mRNA表達呈正相關，與CD8+T細胞浸潤和生存期呈負相關。

        總的來說，這項研究以糖代謝為突破點，發現了糖酵解限速酶HK2能上調腫瘤細胞PD-L1表達，闡明了葡萄糖通過HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1信號通路促進腫瘤免疫逃逸的機製，並在動物模型中證明了抑製HK2能增強CD8+T細胞在腫瘤組織內的浸潤和活化，提高免疫治療療效，改善預後。

        葡萄糖通過HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1促進腫瘤免疫逃逸機製示意圖

        HK2不僅能作為糖代謝酶參與糖酵解，還能作為蛋白激酶參與腫瘤免疫逃逸。這為遏製腫瘤免疫逃逸，提高免疫檢查點抑製劑療效提供了新的靶點和思路。

        參考文獻

        [1] Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014;515(7528):563-567. doi:10.1038/nature14011

        [2] Antonangeli F, Natalini A, Garassino MC, Sica A, Santoni A, Di Rosa F. Regulation of PD-L1 Expression by NF-κB in Cancer. Front Immunol. 2020;11:584626. doi:10.3389/fimmu.2020.584626

        [3] Guo D, Tong Y, Jiang X, et al. Aerobic glycolysis promotes tumor immune evasion by hexokinase2-mediated phosphorylation of IκBα [published online ahead of print, 2022 Aug 19]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00345-X. doi:10.1016/j.cmet.2022.08.002

        [4] Roberts DJ, Miyamoto S. Hexokinase II integrates energy metabolism and cellular protection: Akting on mitochondria and TORCing to autophagy. Cell Death Differ. 2015;22(2):248-257. doi:10.1038/cdd.2014.173

        [5] Garcia SN, Guedes RC, Marques MM. Unlocking the Potential of HK2 in Cancer Metabolism and Therapeutics. Curr Med Chem. 2019;26(41):7285-7322. doi:10.2174/0929867326666181213092652

        [6] Robey RB, Hay N. Mitochondrial hexokinases, novel mediators of the antiapoptotic effects of growth factors and Akt. Oncogene. 2006;25(34):4683-4696. doi:10.1038/sj.onc.1209595

        [7] Ghosh S, Hayden MS. New regulators of NF-kappaB in inflammation. Nat Rev Immunol. 2008;8(11):837-848. doi:10.1038/nri2423

        [8] Shumway SD, Maki M, Miyamoto S. The PEST domain of IkappaBalpha is necessary and sufficient for in vitro degradation by mu-calpain. J Biol Chem. 1999;274(43):30874-30881. doi:10.1074/jbc.274.43.30874